Derivatizzazione5

Nell'organismo i metaboliti di sostanze dopanti, prima di essere escreti nelle urine, sono sottoposti a un processo enzimatico che li trasforma in coniugati (ad es., glucuronidi e solfati), che hanno carattere estremamente polare e idrofilo.
La GC non è però adatta a studiare composti polari e idrofili, perciò è necessario convertire queste sostanze, mediante derivatizzazione, in altre adatte per l'analisi gascromatografica.

In molti farmaci e relativi metaboliti i gruppi funzionali suscettibili di derivatizzazione sono idrossili, chetoni, acidi carbossilici e ammine.
La scelta dei derivati da usare dipende da molti fattori:

L'analisi GC può essere effettuata su composti volatili e con una certa stabilità termica, perciò la derivatizzazione è d'obbligo per composti polari e termolabili, poichè li rende adatti per la GC.
La riduzione della polarità può migliorare le proprietà gascromatografiche del composto, minimizzando l'adsorbimento nella colonna - indesiderabile e non specifico - e permettendo l'ottenimento di migliori forme dei picchi.

La preparazione di un derivato può essere utile anche quando lo spettro di massa del composto non derivatizzato mostra ioni poco diagnostici. La struttura chimica della sostanza cambia dopo la derivatizzazione, perciò il pattern di frammentazione può essere radicamente modificato.
Si possono ottenere spettri di massa con ioni di più alti m/z e più alta abbondanza.

Principali caratteristiche di una buona derivatizzazione:

Principali metodi di derivatizzazione:

Sililazione

E' il metodo di derivatizzazione più ampiamente adottato per analisi GC.
I derivati sililati si formano quando si ha sostituzione di un idrogeno attivo con un gruppo alchilsilile (ad es. in gruppi -OH, -SH, -NH).
Quasi tutti i gruppi funzionali protici presenti in molecole organiche possono essere convertiti in silil eteri o esteri. La capacità di formare silil derivati segue l'ordine seguente:

alcoli > fenoli > acidi carbossilici > ammine > ammidi

La procedura più comune per la loro sintesi è la metilsililazione. I derivati trimetilsilil (TMS) sono i più adatti per la loro stabilità termica e chimica, l'alta volatilità e la facilità di preparazione.
Oltre al TMS si usano anche trimetilalosilani, TMS-ammine, TMS-esteri e TMS-ammidi (la più usata è la MSTFA: N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetammide).
Per permettere la sililazione di funzioni stericamente impedite si possono utilizzare catalizzatori.

Acilazione

Può essere effettuata su molecole con un idrogeno reattivo, come alcoli, ammine, ammidi, tioli, fenoli, enoli, sulfonammidi, composti insaturi e composti aromatici.
Per le reazioni di acilazione si possono usare tre tipi di reagenti: alogenuri acilici, anidridi acide (come l'anidride acetica) o derivati acilici reattivi, come gli imidazoli acilati.

Alchilazione

In questo caso si ha il rimpiazzo di un idrogeno reattivo con un alchile o arile, su gruppi funzionali come acidi carbossilici, alcoli, tioli, fenoli, ammine primarie e secondarie, ammidi e sulfonammidi.
Per la GC-MS di usa per lo più la metilazione, perchè aumenta di poco la massa molecolare e per la volatilità dei derivati metilici.
Per la sintesi di questi derivati si utilizzano alogenuri alchilici, come bromuri e idruri alifatici a basso peso molecolare (metilici, etilici, propilici e isopropilici) e bromuri benzilici.
Come catalizzatori si usano ossido di argento, ossido di bario e idruro di sodio.

Formazione di derivati ciclici

Nel caso di molecole polifunzionali si possono usare reagenti specifici che reagiscono simultaneamente con due gruppi funzionali reattivi vicini (1,2-, 1,3-, 1,4- o, in cicli aromatici, in posizione orto) per formare un derivato ciclico, tipicamente a 5, 6 o 7 termini.
La formazione di cicli può aumentare la stabilità di molecole altrimenti sensibili all'analisi GC.

Derivatizzazione chirale

Le procedure usate per la separazione cromatografica di coppie di enantiomeri si dividono in due categorie principali:

  1. conversione in diastereomeri mediante reazione con un reagente puro otticamente attivo, seguita da separazione su fase cromatografica achirale
  2. separazione diretta su fase stazionaria chirale, senza bisogno di derivatizzazione chirale

Steroidi anabolizzanti

Alcuni steroidi anabolizzanti e molti loro metaboliti non hanno un comportamento cromatografico buono, a causa della presenza dei gruppi idrossilico e chetonico.
Vengono perciò derivatizzati principalmente mediante trimetilsililazione, usando MSTFA, che si lega all'-OH in posizione 17-b, con l'ausilio di un catalizzatore.
La funzione carbonilica in C3 viene derivatizzata utilizzando acetato di potassio o TMSI come catalizzatore, infatti il gruppo carbossilico deve essere prima enolizzato. Il TMSI si può generare in situ per reazione di ioduro d'ammonio e MSTFA.
Si possono anche usare t-butilsilil derivati, per ottenere un maggior aumento della massa molecolare.

Una delle migliori possibilità per diminuire la presenza di testosterone nei controlli antidoping è rappresentata dalla rivelazione diretta di esteri del testosterone nel sangue, usando derivati TMS o perfluoroacilici.


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