Tecniche analitiche

Gli steroidi sono presenti nei fluidi del corpo umano in forma libera e coniugata: gli steroidi liberi sono abbastanza idrofobici, mentre le forme coniugate (glucuronide e solfato) sono idrofiliche.
La solubilità degli steroidi in acqua influenza i metodi di estrazione.

Gli steroidi sono specie non volatili, per cui devono essere derivatizzati5 prima dell'analisi gascromatografica, assorbono nell'UV a 254 nm e non sono fluorescenti, ad eccezione degli estrogeni.
I principali gruppi funzionali degli steroidi, l'idrossile e il gruppo chetonico, hanno una debole reattività, e questo è uno svantaggio per i metodi di analisi che richiedono un'alta sensibilità, come fluorescenza, chemiluminescenza o spettrometria di massa.

Preparazione del campione

Ogni classe di farmaco o sostanza dopante viene sottoposto a un particolare trattamento, prima dell'analisi strumentale vera e propria, che in genere include una purificazione estrattiva, un trattamento chimico o enzimatico (ad es. derivatizzazione o degradazione), seguito dall'analisi cromatografica e di massa.
Nel caso particolare degli agenti anabolici (sia per la frazione libera che per quella coniugata), la comune procedura di screening prevede1:

  1. SPE (solid phase extraction, es. con colonne C18)
  2. idrolisi enzimatica (con b-glucuronidasi e/o aril sulfatasi)
  3. estrazione liquido-liquido
  4. derivatizzazione (sililazione)
  5. cGC-MS (bassa risoluzione, modalità SIM)
  6. cGC-MS ad alta risoluzione (R circa 10000) o cGC-MS-MS

Spettrometria di massa

La spettrometria di massa è la tecnica più impiegata nelle analisi antidoping, specialmente accoppiata con la cromatografia liquida o gassosa, oppure utilizzando la spettrometria di massa tandem MS-MS.
Vengono impiegati vari metodi di ionizzazione, tipicamente6:

Gli analizzatori più impiegati in MS sono invece:

Un'altra applicazione della MS è la IRMS (isotope ratio mass spectrometry), che permette di distinguere tra fonti endogene ed esogene di testosterone, mediante la determinazione del rapporto tra isotopi del carbonio.

La MS in modalità SIM è la tecnica preferita per l'analisi di agenti anabolici, perchè dà migliori detection limit (<1 ng/ml urina).

Gli steroidi androgeni sono stati usati per più di trent'anni anche negli allevamenti di bestiame, finchè la loro somministrazione è stata vietata dalla UE nel 1988, poichè il loro uso è stato collegato allo sviluppo di cancro nell'uomo.
Per determinare queste sostanze nelle urine del bestiame è stato messo a punto un metodo che utilizza la ESI-MS-MS 7, dopo aver derivatizzato la funzione carbonilica in C3 con le idrazine Girard T e Girard P (cloruro di 1-(2-idrazino-2-oxoetil)piridinio) per formare derivati cationici (idrazoni), che vengono appunto determinati analiticamente.
Nei controlli antidoping questi derivati sono molto utili, poichè sono più solubili nel solvente acquoso usato in HPLC.
Il metodo si applica anche ad analisi di neurosteroidi, usando ionizzazione ESI o MALDI, dopo aver derivatizzato con l'idrazina Girard P.

Tecniche cromatografiche

Le tecniche GC, HPLC, elettroforesi capillare (CE) richiedono 40-60 minuti per analisi, e le procedure di preparazione come estrazione o derivatizzazione ne prolungano ulteriormente la durata. Invece i saggi clinici degli steroidi dovrebbero essere eseguibili in pochi minuti.

HPLC
A questo scopo sono state sviluppate tecniche più rapide come l'HPLC con colonna "microbore" (3-5 cm di lunghezza, 1-2 mm di diametro interno) e gel (spessore 1-2 mm); questa metodologia richiede solo 5 minuti per campione.
Per l'analisi degli steroidi inoltre viene spesso utilizzata l'HPLC-RP (a fase inversa) con colonne C18.
Recentemente è stata introdotta anche la cHPLC (capillary HPLC), che ha un diametro interno di 300 mm, utilizza flussi di fase mobile molto bassi (1 ml/min) e necessita di volumi di campione molto piccoli (1-2 ml); viene usata in accoppiamento con la MS, con ionizzazione ESI, senza necessità di una derivatizzazione precolonna degli steroidi2.

CE
La CE richiede piccoli volumi di campione (1-2 ml), tuttavia dà separazioni rapide e con alta risoluzione.
Gli steroidi formano micelle con un surfattante cationico in una soluzione tamponata e migrano per effetto dell'elettricità; vengono quindi rivelati da uno spettrofotometro UV a 254 nm e da una barra a fotodiodi, dopo separazione con CE 2.

La separazione degli steroidi anabolizzanti androgeni mediante MEKC (micellar electro-kinetic capillary cromatography) è stata poco studiata, tuttavia una ricerca14 riporta la separazione simultanea degli endogeni androstenedione, dei due a-epimeri testosterone ed epitestosterone, e di due steroidi anabolici sintetici, mediante la PF-MEKC (partial filling MEKC), che utilizza come surfattanti il sodio dodecil solfato e il sodio taurocolato.

GC
Anche le tecniche gascromatografiche sono state implementate, specialmente da quando la cGC (gascromatografia capillare) ha rimpiazzato le colonne impaccate anche nei laboratori antidoping. La GC viene usata sia come tale che accoppiata con la MS.

Analisi degli agenti anabolizzanti mediante GC1

Per riconoscere una potenziale somministrazione di testosterone, la sua concentrazione viene normalizzata determinando il rapporto tra la concentrazione di testosterone e del suo epimero epitestosterone (T/E).
Sebbene l'epitestosterone sia biosintetizzato col testosterone, è fisiologicamente inattivo.

Secondo la C.I.O., un rapporto T/E maggiore di 6 è considerato sospetto e permette quindi ulteriori approfondimenti sulla causa di questo valore elevato (valore normale ca. 1).

La quantificazione di testosterone ed epitestosterone in basse concentrazioni è perciò essenziale nelle analisi antidoping, così come la determinazione di altri composti correlati come precursori, composti "accompanying", metaboliti, "steroid profiling".

Recentemente è stata usata la IRMS (isotope ratio mass spectrometry), dopo separazione cromatografica mediante GC, per distinguere fonti endogene di testosterone da quelle esogene, attraverso la valutazione del rapporto 12C/13C.

L'isolamento della frazione libera e coniugata di questa classe di composti viene di solito effettuata mediante la SPE e l'estrazione liquido-liquido, con o senza idrolisi dei coniugati.
Gli agenti anabolici e i loro metaboliti sono di solito trasformati nei derivati TMS (oppure O-TMS o N-TMS) prima della separazione gascromatografica (derivatizzazione).

Fluorescenza e chemiluminescenza

A volte gli steroidi sono presenti nei fluidi umani in concentrazioni troppo basse da essere rivelate dalle tecniche analitiche più comuni, perciò in questi casi sono richiesti metodi ad alta sensibilità come fluorescenza e chemiluminescenza.

Poichè gli steroidi non sono fluorescenti (eccetto gli estrogeni) è necessario derivatizzarli.
Le tecniche utilizzate a tale scopo sono:

La determinazione degli steroidi con la chemiluminescenza avviene utilizzando lucigenina e perossiossalato 2.


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