Biomonitoraggio

Valutare l'azione di un enzima, ovvero il biomonitoraggio, risulta essere notevolmente importante sia in campo medico e biologico, sia per risvolti pratici, ad esempio nel campo della catalisi. Quindi il biomonitoraggio è un'interessante area di ricerca estesa e in continuo sviluppo ed evoluzione.

Biomonitoraggio della MMP-2

Bioconiugazione di Cy5.5 sulla proteina
       
Le proteasi sono una tipologia di enzimi coivolta nella formazione di tumori, nell'angiogenesi, in invasioni locali e nella diffusione metastatica. La famiglia delle metalloproteasi della matrice (MMP), comprendente oltre venti sottotipi di enzimi, ha ricevuto notevole attenzione; in particolare la MMP-2 (gelatinasi) degrada la matrice extracellulare ed è coinvolta nella proliferazione di tumori e nella neovascolarizzazione indotta da tumori.
E' possibile monitorare l'attività della MMP-2 attraverso l'utilizzo della spettrofluorimetria. Ad una proteina, che svolge il ruolo di trasportatore, viene innestata su una sequenza di poli-Lisina un colorante che presenti fluorescenza nel vicino infrarosso, quale la Cy 5.5, coniugandola agli atomi di azoto terminali della Lisina. Il colorante viene eccitato in maniera specifica attraverso radiazione laser, e finchè non si ha l'intervento della MMP-2 che lo taglia dal peptide non emette fluorescenza.
Una volta che la cianina viene liberata, questa emette radiativamente. Ciò permette di monitorare l'attività della proteasi, in quanto misurando la fluorescenza emessa si può valutare la quantità di marker che viene liberata in seguito al "taglio" operato dall'enzima.
Ci sono diversi fattori che rendono questo approccio superiore alle convenzionali tecniche di imaging:
  • l'attivazione del colorante è molto specifica (determinata dal substrato peptidico);
  • fluorofori multipli possono venire trasportati da un singolo trasportatore;
  • un singolo enzima può attivare ripetutamente coloranti multipli;
  • la matrice, permettendo un efficace quenching, ha un effetto molto minore, se comparato ai metodi convenzionali di imaging.

Biomonitoraggio della SOD
La superossidodismutasi (SOD) è un enzima che si trova nei mitocondri di tutte le cellule degli organismi aerobi e in molti organismi vegetali. Il suo ruolo biologico è quello di demolire lo ione superossido O2-., il quale è un generatore di ROS, specie reattive all'ossigeno in forma di radicali. I radicali, essendo specie difettive dal punto di vista elettronico, sono molto reattivi e cercano sempre nuove fonti elettroniche per colmare la propria lacuna elettronica. In questo senso, un loro tipico punto d'interazione sono i doppi legami di molecole organiche insature su cui effettuano un attacco radicalico; questi possono essere trovati ad esempio nei fosfolipidi che costituiscono le membrane cellulari. Ciò risulta essere molto pericoloso in quanto per effetto dell'attacco si passa da una specie insatura ad una satura, che può dare ingombro ai successivi fosfolipidi, e pertanto si viene a creare un difetto nella membrana cellulare.
Quindi risulta essere di una certa importanza e utilità poter monitorare l'attività della SOD, che si occupa di catalizzare la distruzione dello ione superossido, specie particolarmente insidiosa, in quanto oltre che essere radicalica e generatrice di radicali, è già di per sè citotossica, se in elevata concentrazione.

Meccanismo catalitico della SOD
La superossidodismutasi è un enzima manganese-dipendente, in cui il manganese, centro catalitico della molecola, si occupa, attraverso la seguente serie di passaggi redox, di catalizzare la demolizione dello ione superossido:
O2-. + Mnn+1 = O2 + Mnn+
Mnn+1 + HO2- + H+ = H2O2 + Mnn+1

Il risultato è quindi, in virtù dell'intervento della SOD, il seguente:
O2-. = O2 + H2O2         DISMUTAZIONE DELLO IONE SUPEROSSIDO
H2O2 è un'altra specie citossica, ma meno pericolosa se comparata allo ione superossido, la cui demolizione è affidata ad enzimi ferro-dipendenti, che ne catalizzano la riduzione ad H2O.

Fino ad oggi le metodiche seguite per determinare l'attività della SOD sono stati la spettrofotometria, la chemiluminescenza, l'HPLC, la risonanza paramagnetica elettronica (EPR). Queste procedure, tuttavia, presentano alcuni svantaggi: le apparecchiature per l'EPR sono eccessivamente costose, le operazioni per l'HPLC sono complicate, la selettività della chemiluminescenza è scarsa e la sensibilità della spettrofotometria risulta bassa.
Un nuovo metodo per effettuare un biomonitoraggio consiste nell'utilizzo della spettrofluorimetria, che è più semplice, più sensibile e più selettiva; in particolare, la procedura seguita è la Flow Injection Analysis (FIA), che presenta una maggiore riproducibilità e che consente analisi in tempo reale e automatizzate.
Nel circuito di reazione sono presenti tre flussi variabili nel tempo utilizzando delle valvole che controllano delle pompe peristaltiche: il primo è costituito da una soluzione basica satura di O2 di Na2S2O4, che viene utilizzato come sorgente di produzione di O2-., secondo la reazione: S2O42- + O2+ 4 H2O = 2 SO32- + 2 H2O + O2-.. La reazione è immediata, spontanea e quantitativa. Il secondo flusso è una soluzione acquosa di SOD. Infine, il terzo è una soluzione in etanolo di un colorante, la 2-(2-piridil)-benzotiazolina, la cui struttura è di seguito riportata:

2-(2-piridil)-benzotiazolina        

Se lo ione superossido incontra la SOD, viene demolito. Se invece incontra la 2-(2-piridil)-benzotiazolina, la ossida secondo la reazione:

Ossidazione della 2-(2-piridil)-benzotiazolina

La 2-(2-piridil)-benzotiazolina non è fluorescente, mentre lo è il suo prodotto di ossidazione.
La soluzione di 2-(2-piridil)-benzotiazolina scorre costantemente nel reattore fino a raggiungere il detector, che misura la fluorescenza in tre diverse situazioni:
  • Fs è la fluorescenza misurata quando viene aggiunta una certa quantità (nota) di SOD;
  • F è la fluorescenza misurata quando vengono aggiunte sia la soluzione di SOD che quella di tiosolfato, quindi è la fluorescenza dovuta al prodotto della reazione di ossidazione della 2-(2-piridil)-benzotiazolina da parte dello ione superossido, decurtata in parte dalla reazione biochimica di demolizione dello ione superossido da parte della SOD;
  • F0 è la fluorescenza misurata quando non passa nessuna delle due specie, ma solo la soluzione di 2-(2-piridil)-benzotiazolina.
L'attività della SOD può quindi essere valutata percentualmente in base al seguente parametro P:

P = (F - Fs)/(F - F0) x 100