Imaging ottico tumorale

Principio del metodo
L'imaging ottico tumorale è una moderna tecnica diagnostica in grado di rilevare tessuti affetti da patologie tumorali attraverso l'utilizzo della spettrofluorimetria. Questa tecnica permette una visualizzazione della zona d'interesse con una risoluzione spaziale maggiore rispetto ad altre tecniche diagnostiche non invasive quali la tomografia computerizzata o l'imaging di risonanza magnetica.
La metodica consiste nel somministrare al paziente una molecola (marker) contenente un gruppo fluoroforo che interagisca con le cellule dell'area da analizzare svolgendo il ruolo di tracciante. Un tracciante è una sostanza che presenta la particolare caratteristica che una volta eccitata da una precisa lunghezza d'onda, sia in grado di dare una fluorescenza più intensa quando si trovi in cellule tumorali rispetto a quando sia situata in cellule sane. Le molecole utilizzate come marker sono in genere dei coloranti fluorescenti, ad esempio delle cianine, le quali si legano all'esterno della cellula sulla membrana cellulare, oppure al suo interno sul DNA tumorale, o più in generale ad un elemento, come può essere una proteina, che differenzi una cellula malata da una sana. In alternativa, si può sfruttare un componente intracellulare fluorescente come biomarker.
L'analisi viene effettuata eccitando otticamente il marker al fine di ottenere fluorescenza, la quale viene rilevata da uno spettrofluorimetro. Come fonte di radiazione monocromatica, si utilizzano preferenzialmente laser, i quali sono in grado di produrre raggi estremamente stretti e precisi.
Il prodotto dell'indagine è uno spettro di fluorescenza della regione interessata. Dallo spettro inizialmente ottenuto, tramite un filtro, si ricava un'immagine comprensiva sia delle regioni sane che di quelle tumorali. Effettuando poi una sottrazione digitale dell'immagine si evidenzia il contrasto della zona tumorale rispetto all'intorno sano.

Immagine di cellula sana       Immagine di cellula tumorale

Schema della strumentazione

Strumentazione per Imaging Ottico Tumorale

L'apparato mostrato nell'immagine sopra riportata viene utilizzato per esaminare in tempo reale tessuti biologici (BT) durante operazioni di asporto chirurgico di tessuti tumorali; in questo modo è possibile monitorare costantemente la zona di interesse al fine di rimuovere con precisione la parte malata. In particolare, questa strumentazione viene usata durante interventi di rimozione di tessuto cerebrale affetto da patologie tumorali.
Il tessuto biologico è continuamente esposto a luce ambientale (2) e periodicamente viene irradiato con luce monocromatica di opportuna lunghezza d'onda proveniente da un laser, ad esempio un laser Nd:YAG (3). La sorgente monocromatica lavora ad impulsi scanditi da un interruttore (4) controllato da un oscillatore (5). L'intervallo tra un impulso e l'altro può essere costante oppure sincronizzato con il battito caridaco, l'attività respiratoria oppure con altri parametri.
La strumentazione prevede l'utilizzo di un detector CCD (6), sincronizzato con l'impulso tramite un oscillatore, che rileva i fotoni emessi dalla specie di interesse. Il detector riceve due input: il primo durante l'impulso, quando rileva la radiazione complessiva delle sorgenti 2 e 3, mentre il secondo nell'intervallo tra due impulsi quando rileva la sola radiazione proveniente dalla sorgente 2. I dati in ingresso vengono raccolti in un processore (rappresentato dalla linea tratteggiata P) che digitalizza il segnale (7) e sottrae (8) i due input, producendo un segnale differenziale che consiste della sola radiazione proveniente dalla fluorescenza. Infine, i segnali differenziali ottenuti vengono amplificati da un amplificatore (9) controllato in modo da ottenere l'amplificazione desiderata.
Una videocamera a colori (11) viene posta in modo tale da visualizzare la zona da operare. Grazie ad un dispositivo sommatorio (10) è possibile sovrapporre l'immagine reale proveniente dalla videocamera con quella digitale ottenuta come output dal processore; ovvero è possibile sovrapporre l'immagine del tessuto tumorale sull'immagine dell'intorno degli altri tessuti del sito chirurgico, la quale viene visualizzata su di un display (12).
Prima di iniziare l'operazione chirurgica, al paziente viene somministrato il tracciante. Le immagini che si ottengono sono di assistenza al chirurgo durante l'operazione di rimozione del tessuto malato, permettendo quindi una chirurgia più completa e accurata. Grazie a questa strumentazione, è possibile ottenere immagini in tempo reale della zona d'interesse, permettendo quindi di operare senza interruzioni o perdite nell'identificazione del tumore.

Sostanze traccianti
I parametri che definiscono un buon agente di contrasto sono: stabilità, efficacia, non tossicità, distribuzione in vivo, tempo di permanenza nell'organismo e destino metabolico.
Le sostanze traccianti sono divise in tre categorie generali:

Gli agenti specifici e non specifici sono sostanze intrinsecamente fluorescenti, con la differenza che le prime interagiscono con un ben specifico sito.
Gli agenti attivabili tipicamente incrementano l'intensità della propria fluorescenza in seguito ad un'interazione. Quando vengono somministrati al paziente sono inattivi e solo dopo l'intervento degli enzimi presenti nelle zone tumorali diventano rapidamente fluorescenti. Ciò permette una più facile rilevazione dei tumori. In aggiunta, rispetto agli agenti non specifici, solitamente di basso peso molecolare, gli agenti attivabili rimangono sul loro bersaglio per un lungo periodo di tempo. Molti agenti attivabili emettono fluorescenza nel vicino infrarosso e ciò garantisce una penetrazione più profonda del segnale rispetto alla luce visibile.
Infine, come già detto in precedenza, si può sfruttare un opportuno componente intracellulare come biomarker, il che presenta alcuni ovvi vantaggi, quali ad esempio quello di non dover somministare al paziente alcuna sostanza, evitando in questo modo eventuali problemi di biocompatibilità e di rimozione della sostanza tracciante ad analisi terminata.

Per indagini su tessuti cerebrali, utilizzando l'apparecchiatura precedentemente descritta, il metodo preferenziale per evidenziare il contrasto tra cellule sane e cellule malate è quello di accumulare e/o sintetizzare porfirine endogene, come la porfirina IX, che svolgano il ruolo di biomarker intracellulare per la fluorescenza.
Si sceglie questa strada poiché il vantaggio principale è di restringere il fenomeno della fluorescenza alle sole cellule cancerogene, senza contaminazione della cavità tumorale dovuta al marker portato in circolo dal sangue o alla sua diffusione nel tessuto peri-tumorale, oltre ai già citati vantaggi risultanti dall'utilizzo di biomarker.
In aggiunta, si somministra al paziente dell'acido 5-amminolevulinico, che Ŕ coinvolto nella sintesi della porfirina IX: in questo modo viene aumentata la quantità di fluoroforo nelle cellule tumorali, migliorando in tal modo la risoluzione.
               
Sintesi della porfirina IX Acido 5-amminolevuinico Porfirina IX

Nanolaser per imaging ottico
Le nanotecnologie vengono considerate una promettente nuova direzione nella rilevazione, diagnosi e trattamento del cancro. Attualmente lo studio delle cause del cancro è rivolto verso i mitocondri, organelli intracellulari che giocano un importante ruolo nel metabolismo energetico cellulare, nella generazione di radicali liberi e nell'apoptosi. Recenti studi hanno dimostrato che alterazioni genetiche e/o metaboliche nei mitocondri causano o contribuiscono nel causare una gran varietà di malattie, incluso il cancro. La chiave di lettura è la scoperta di differenze biofotoniche tra cellule normali e cellule cancerogene, e a questo scopo i mitocondri vengono usati come biomarker.
Vista l'importanza dei mitocondri nello sviluppo di problemi come il cancro, è cruciale sviluppare metodi per rilevare cambiamenti in essi; tecniche ottiche possono giocare un ruolo importante nella rilevazione del cancro, in quanto hanno la capacitÓ di individuare molto velocemente le cellule malate.
L'obiettivo della ricerca in questo senso sta nel trovare dei nanolaser di dimensioni sufficientemente piccole per poter analizzare il tessuto malato cellula per cellula: ciò si traduce nella riduzione del diametro del fascio di luce laser che irradia il tessuto. Inoltre, come illustrato in precedenza, la potenzialità del laser in spettrofluorimetria sta nella risposta immediata, permettendo di ottenere immagini in tempo reale durante un'operazione.