Spettrometria di massa (MS) [27]

La MS occupa una posizione molto importante tra le tecniche analitiche adottate nel campo della viticoltura e dell'enologia. Dopo le prime applicazioni della GC-MS nello studio dell'aroma del vino, e del FAB nella determinazione dei suoi polifenoli, attualmente i più comuni metodi per l'analisi di polifenoli e antocianine sono quelli della LC-MS: la possibilità di ottenere una ionizzazione soft e la minore necessità di purificazione del campione rendono questa tecnica adatta allo studio di una matrice complessa come il vino. La LC-MS è stato il più efficace strumento di studio delle reazioni di polimerizzazione delle antocianine con altri composti, che avvengono nel vino durante l'invecchiamento e sono responsabili dei suoi cambiamenti di colore; per mezzo degli spettri di massa sono state così confermate le strutture dei prodotti di questi processi, che erano state precedentemente ipotizzate.
L'importanza e la diffusione della MS sono legate alla varietà delle tecniche che possono essere accoppiate ad essa; grazie alla loro complementarietà è possibile studiare la grande varietà di polifenoli presenti non solo nel vino, ma anche in molti altri alimenti. Per esempio, la LC-MS è adatta per l'analisi delle procianidine ma può analizzare solo quelle con un basso livello di polimerizzazione (fino ai pentameri), perchè, con l'aumento della massa molecolare, cresce il numero dei diastereoisomeri e diventa impossibile separarli; questo limite, però, viene superato con la tecnica MALDI-TOF, che può essere applicata fino ai nonameri.

Analisi di polifenoli e procianidine

Negli anni '70 del Novecento si usava la GC-MS per lo studio dell'aroma di uva e vino. Non sono riportati in letteratura, invece, casi di utilizzo della tecnica nell'analisi dei polifenoli, a causa della loro scarsa volatilità, che richiederebbe una derivatizzazione: questo espediente avrebbe lo svantaggio di generare prodotti spesso non determinabili per mezzo della MS, a causa della loro massa molecolare troppo elevata.
Perciò il primo metodo di analisi di questi composti consisteva in un'idrolisi, o una tiolisi, i cui prodotti venivano poi identificati per mezzo di LC, MS o TLC.
Sull'applicazione della MS a polifenoli non derivatizzati, uno dei primi studi fu pubblicato nel 1990: nella ricerca, estratti di uva venivano analizzati per mezzo della tecnica FAB nelle modalità "ione positivo" e "ione negativo".
Dagli anni '90, lo sviluppo di sistemi efficaci di LC-MS ha reso disponibili strumenti molto utili per la scoperta delle strutture dei polifenoli e per lo studio delle reazioni in cui questi composti sono coinvolti durante l'invecchiamento del vino: ancora nel 1990, per mezzo di un sistema di LC-MS dotato di una sorgente di ionizzazione ESI (electro spray ionization), furono analizzati i tannini, che sono oligomeri e polimeri dei flavanoli. Nell'analisi dei flavanoli la ESI, rispetto alla APCI, è più efficace e garantisce una maggiore sensibilità.

Analisi delle antocianine

Per l'analisi delle antocianine del vino si usa solitamente la LC a fasi inverse, con rivelazione a 520 nm; nella figura è riportato un esempio di cromatogramma ottenuto con questa tecnica:

cromatogramma HPLC

Con una semplice LC, l'assegnazione dei picchi può essere effettuata solo sulla base dei tempi di ritenzione; per ottenere dati più affidabili, bisogna ricorrere alla MS.
Anche nel caso delle antocianine, uno dei primi studi sull'impiego della MS riguarda il FAB: la ricerca è del 1985. In un altro lavoro, del 1994, la LC-MS a fasi inverse viene invece accoppiata al CF-FAB. Fino a pochi anni fa, il FAB era la più comune tecnica di MS applicata alle antocianine, nonostante lo svantaggio rappresentato dalla necessità di purificare il campione e di dissolverlo in una matrice polare; attualmente, invece, si preferisce la ESI, che non richiede trattamenti prima dell'analisi. Il campione può anche essere iniettato direttamente nella sorgente ESI, senza che prima sia stato separato per mezzo di una LC; deve però essere stato purificato con una SPE. Esempio di spettro ottenuto in questo modo:

spettro ESI


FAB (fast atom bombardment) e CF-FAB (continuous flow - fast atom bombardment)

Il FAB è una sorgente di ionizzazione per MS.
Un fascio di ioni Ar+ di energia controllata (2-10 keV) viene inviato in una camera di collisione che contiene Ar. Dalla camera di collisione viene emesso un fascio costituito da una miscela di Ar e Ar+, con la stessa energia del fascio originario; la componente ionica viene separata per mezzo di una serie di piatti elettrostatici deflettori.
Per essere introdotti nel sistema, i materiali vengono depositati, in soluzione, su una piattaforma metallica fissata allo stelo di una sonda, che viene inserita in modo da intercettare il flusso di atomi veloci. Gli ioni espulsi per sputtering dal campione vengono accelerati verso lo spettrometro.
Questa sorgente di ionizzazione è molto versatile: è compatibile con molecole organiche e organometalliche anche abbastanza grandi, con i complessi metallici e con i loro sali. Gli spettri ottenuti con questo tipo di ionizzazione sono caratterizzati da alta sensibilità verso gli ioni pseudomolecolari (M+H)+ e (M-H)-:

spettro FAB

La ionizzazione può avvenire a temperatura ambiente perchè non è necessaria la volatilizzazione del campione: questo evita eventuali problemi di degradazione termica. Inoltre, la preparazione è semplice perchè non sono richieste purificazioni o derivatizzazioni.

Lo svantaggio del FAB statico consiste nel grande rumore di fondo causato dalla necessità di disperdere il campione in una matrice. Per questo motivo è stato creato il CF-FAB, in cui la sonda usata per l'introduzione del campione consente un flusso continuo di liquido trasportatore contenente una bassa concentrazione di matrice organica; tra i componenti di questo liquido ci sono l'acqua, che garantisce un basso rumore di fondo e quindi un'alta sensibilità, e un solvente volatile, come l'acetonitrile o il metanolo, che consente di inserire il CF-FAB come interfaccia tra LC e MS. Il liquido trasportatore, per azione di una pompa a siringa, fluisce in un capillare di silice contenuto nella sonda e raggiunge un bersaglio collocato sulla sua punta.

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MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)

La MALDI è una tecnica di ionizzazione soft, che solitamente opera sotto vuoto ma può anche funzionare a pressione ambiente (AP-MALDI), però con una minore sensibilità.
Il campione viene assorbito su una matrice, solitamente organica (glicerolo, acido succinico,...), che viene dissolta e poi bombardata con un fascio laser. La matrice deve essere facilmente evaporabile ma non deve volatilizzarsi significativamente prima dell'analisi; inoltre, deve avere un certo carattere acido che le consenta di ionizzare gli analiti per protonazione, deve assorbire molto nell'UV per interagire con il laser e deve avere gruppi polari. Il laser causa il rilascio del campione complessato con la matrice (desorbimento), che lo protegge attenuando gli effetti del bombardamento: infatti gli analiti vengono ionizzati e vaporizzati per mezzo dell'energia in eccesso ceduta dalla matrice. Si generano, così, gli ioni pseudomolecolari (M+H)+ e (M-H)-.
La MALDI è spesso accoppiata a spettrometri dotati di analizzatore a tempo di volo (MALDI-TOF). E' adatta per analiti termolabili con alta massa molecolare, come i biopolimeri (proteine, peptidi, polisaccaridi,...).

apparecchiatura MALDI
diagramma semplificato dell'apparecchiatura MALDI

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