Analisi per mezzo della fluorescenza [33]

Alcuni fenoli hanno assorbanze caratteristiche nell'UV-Vis, che permettono la loro rivelazione per mezzo di un DAD: le antocianine, che sono rosse, presentano un massimo di assorbanza intorno a 520 nm; i flavonoli, gialli, hanno un massimo intorno a 360 nm; gli acidi idrossicinnamici hanno un'alta assorbanza intorno a 320 nm. Sfortunatamente, la maggior parte dei polifenoli del vino non manifesta un'assorbanza specifica e ha un massimo intorno a 280 nm, come tutti i fenoli citati prima.
Invece i flavanoli si distinguono per le loro proprietà di fluorescenza che gli altri polifenoli del vino non hanno: se si usa un rivelatore a fluorescenza (FD), il limite di determinazione dei flavanoli può essere abbassato e le interferenze da parte di altri fenoli possono essere evitate. Il metodo ha però un limite: quando i flavanoli reagiscono con l'acido gallico e generano i gallati, le proprietà di fluorescenza vengono perse e bisogna ricorrere alla misurazione dell'assorbanza a 280 nm.

Un articolo del 2007 descrive un'analisi di polifenoli per mezzo di HPLC accoppiata a un DAD e a un FD (fluorescence detector). Con il DAD si registrano i cromatogrammi a 280, 320, 360 e 520 nm, con il FD si registra quello corrispondente all'eccitazione a 280 nm e all'emissione a 320 nm.

Assorbanza a 320 nm: spettro 320 nm

Assorbanza a 360 nm: spettro 360 nm

Assorbanza a 520 nm: spettro 520 nm

Assorbanza a 280 nm (in alto) ed
emissione di fluorescenza a 320 nm (in basso):
spettri 280 nm e 320 nm

La separazione cromatografica viene eseguita con una fase mobile ternaria e con un'eluizione in gradiente:

tabella gradiente

Il pH viene ridotto da 2.6 a 1.5 per separare le antocianine, in forma cationica, dagli altri fenoli.
L'identificazione dei fenoli analizzati avviene sulla base dell'ordine di eluizione, dei tempi di ritenzione e degli spettri UV-Vis.
A parte poche eccezioni, i limiti di quantificazione sono inferiori a 1 mg/L:

tabella limiti di quantificazione

Un risultato importante ottenuto in questa ricerca è quello di aver identificato una grande quantità di flavonoli, uno dei gruppi studiati per ultimi tra i fenoli del vino. La tecnica utilizzata presenta molti vantaggi: non richiede preparazione del campione o frazionamento precedente all'analisi, non si osservano sovrapposizioni di picchi nel cromatogramma, e i rivelatori garantiscono precisione, accuratezza e una sensibilità adatta per l'applicazione di questo metodo al vino.


DAD (diode array detector)

Il DAD è una serie di diodi fotosensibili affiancati ma separati l'uno dall'altro, in modo da costituire un sandwich multistrato. I diodi possono essere spessi solo qualche micron, e il segnale proveniente da ognuno può essere interpretato, memorizzato e successivamente elaborato da un computer in molti modi diversi. La sorgente luminosa è solitamente policromatica, come una lampada al deuterio. Dopo aver attraversato la cella contenente gli analiti, la luce viene dispersa sulla superficie del DAD da un prisma di quarzo o da un reticolo di diffrazione: perciò ogni diodo riceve una radiazione di lunghezza d'onda leggermente diversa da quella ricevuta dai suoi vicini. E' necessaria la presenza di un numero di diodi sufficiente a coprire l'intervallo di lunghezze d'onda utili per l'analisi che si vuole eseguire.
Il DAD può essere usato per determinazioni qualitative o quantitative: nel primo caso si registra tutto lo spettro della sostanza incognita, nel secondo caso si privilegia la sensibilità selezionando una sola lunghezza, corrispondente al massimo assorbimento dell'analita.

apparecchiatura DAD

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FD (fluorescence detector)

Nel FD a singola lunghezza d'onda di eccitazione, una lente di quarzo fa convergere la radiazione UV sulla cella contenente il campione; una seconda lente, perpendicolare alla luce incidente, raccoglie la radiazione di fluorescenza e la invia al rivelatore:

schema FD

La radiazione che eccita gli analiti proviene solitamente da una lampada al mercurio a bassa pressione, che è relativamente economica e fornisce una radiazione UV abbastanza intensa a 253.7 nm: questa lunghezza d'onda è capace di eccitare molte sostanze dotate di proprietà fluorescenti.
Il FD a singola lunghezza d'onda è probabilmente il più sensibile rivelatore per LC disponibile (sensibilità di circa 10-9 g/mL), ma questa caratteristica viene ottenuta a spese della versatilità.

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