FI-CL (Flow-injection chemiluminescence) nell'analisi del resveratrolo [28;29;30]

La chemiluminescenza

La chemiluminescenza è l'emissione di radiazione elettromagnetica a causa dello sviluppo di energia in seguito a una reazione chimica: dai reagenti si ottiene infatti un intermedio eccitato che, tornando allo stato fondamentale, emette luce.

[A] + [B] → [I*] → [Products] + hν

La radiazione può essere emessa nella regione dell'ultravioletto, del visibile o dell'infrarosso, ma più comunemente essa cade nell'intervallo del visibile.
Per raggiungere la massima sensibilità, una reazione di chemiluminescenza deve essere il più efficiente possibile nella generazione di fotoni (al massimo uno per ogni gruppo o composto luminescente formato). L'efficienza è espressa da un parametro ΦCL detto resa quantica, che può variare da 0 (reazione non chemiluminescente) a 1 (ogni molecola che reagisce genera un fotone), secondo l'equazione:

ΦCL = ΦCE·ΦF·ΦR

dove ΦCE è la resa quantica del processo di eccitazione (il valore massimo, 1, indica che tutte le molecole di prodotto sono generate in stato eccitato), ΦF è la resa quantica della fluorescenza (indica la percentuale di molecole eccitate che decadono attraverso tale processo) e ΦR è la resa quantica della reazione (cioè la percentuale di molecole che reagiscono secondo il meccanismo che porta alla luminescenza). Nel caso in cui la ΦF fosse troppo bassa è possibile aumentare la resa quantica totale introducendo nel sistema una molecola altamente fluorescente che sia in grado di accettare un trasferimento di energia da parte delle molecole di prodotto eccitate riemettendola sotto forma di luce. In questo caso bisogna introdurre nell'equazione sopra riportata un termine ΦET (resa quantica del trasferimento di energia) e sostituire la ΦF del prodotto con quella della molecola fluorescente introdotta.

I metodi analitici che sfruttano la chemiluminescenza sono dotati di grande versatilità nella determinazione di un'ampia gamma di specie, accompagnata da alta sensibilità, ampio range lineare, buona riproducibilità e semplicità dell'apparecchiatura. La reazione, infatti, è di per sè una fonte luminosa ed è quindi necessario solo misurare l'intensità della radiazione e registrare il segnale. Per quanto riguarda la sensibilità i vantaggi sono costituiti dall'assenza di segnale di fondo in molti campioni (cioè essi non emettono luce) e dal fatto che la misura non implichi un rapporto fra grandezze (come ad esempio succede per l'assorbanza).
Per ottenere un elevato grado di sensibilità è necessario utilizzare un detector particolarmente efficiente in corrispondenza dei picchi dello spettro di chemiluminescenza.


Analisi del resveratrolo tramite FI-CL

L'apparecchiatura usata è la seguente:
Schema dell'apparecchiatura: (a) soluzione campione, (b) soluzione HCHO, (c) flusso di acqua, (d) soluzione di KMnO4, (e) soluzione H2SO4. P1 e P2: pompe peristaltiche; V: valvola di iniezione a 8 vie; F: cella per chemiluminescenza in flusso; W: soluzione di scarto; PMT: tubo fotomoltiplicatore; HV: sorgente di alto voltaggio; PC: computer.

Il resveratrolo è estratto dal vino utilizzando una colonna C18 a fase inversa e determinato tramite il metodo della chemiluminescenza a iniezione in flusso.
Una pompa peristaltica a due canali è usata per portare le soluzioni di campione e di HCHO con un flusso di 2.0 mL/min; un'altra pompa peristaltica, a tre canali, trasporta l'acqua e le soluzioni di KMnO4 e di H2SO4 con un flusso di 3.5 mL/min. Il segnale di chemiluminescenza è misurato con un tubo fotomoltiplicatore R456 a -800V (senza distinzione fra le varie lunghezze d'onda). Sono anche misurati i segnali di fluorescenza e di assorbimento UV.
Il limite di determinazione è di 3.30·10-9 M (3σ) e la deviazione standard relativa su 11 misure parallele è del 3.8%.

Meccanismo della reazione di chemiluminescenza.

La formaldeide può essere ossidata dal permanganato di potassio mostrando una debole chemiluminescenza durante la formazione di CO2. È stata notata un'emissione, più forte della precedente, anche nel sistema KMnO4-resveratrolo. Quando sono presenti tutti e tre i reagenti, la chemiluminescenza risulta incrementata e superiore a quella dei due sistemi separati, pur mantenendo la stessa forma dei picchi. Si può dunque concludere che l'emettitore è lo stesso e che la presenza contemporanea del resveratrolo e della formaldeide aumenta l'efficienza quantica della luminescenza.
Il meccanismo proposto è il seguente:

MnO4- + H+ + resveratrolo → 1O2(1Δg) + Mn2+ + M* + H2O
2MnO4- + 6H+ + 5HCHO + 2H2O → 5HOCH2OOH + 2Mn2+
HOCH2OOH + M* → HOCH2OO* + HM
2HOCH2OO* → HCHO + HCOOH + 1O2(1Δg) + H2O
21O2(1Δg) → 1O21O2(1Δg)(1Δg)
1O21O2(1Δg)(1Δg) → 23O2(3ΣR) + hν

dove M* è il prodotto radicalico. In conclusione, nel sistema acido contenente resveratrolo, KMnO4, e HCHO, si può generare 1O2, specie che emette radiazione elettromagnetica:
2 O2(1Dg) → 2 O2(3Sg) + hv (630 nm)
In presenza di HCHO aumenta l'efficienza quantica della chemiluminescenza.