MS nell'analisi del resveratrolo [27]


I primi utilizzi della spettrometrie di massa per la determinazione del resveratrolo nel vino erano basati sull'uso della GC-MS. Per poter eseguire questo tipo di analisi è però necessario che gli analiti siano volatili: la molecola deve quindi essere derivatizzata, ad esempio utilizzando la bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetammide (BSTFA). I due isomeri possono essere separati e identificati grazie al differente tempo di ritenzione.
L'estrazione più largamente utilizzata, una volta abbandonata l'estrazione con solvente, è quella in fase solida (SPE) con una cartuccia C18. La colonna usata è una DB-5HT (5% fenile, 95% metile).
Lo spettro di frammentazione con ionizzazione chimica (EI) a 70 eV è riportato in figura, per la determinazione quantitativa in modalità SIM (single ion monitoring) è usato lo ione con m/z = 444 (limite di rivelabilità di ~10 μg/L):
Frammentazione del resveratrolo
Spettro di frammentazione del resveratrolo con ionizzazione chimica a 70 eV

Poichè il cis-resveratrolo non è stato rilevato nè nelle bucce nè nel succo d'uva, si è ipotizzato che avvenga l'isomerizzazione del trans-resveratrolo durante la fermentazione. Gli studi sugli altri idrossistilbeni hanno mostrato che il diidrossistilbene viene eluito prima del cis-resveratrolo mentre il tetraidrossistilbene viene eluito dopo l'isomero trans.
Sono poi stati proposti metodi basati sulla cromatografia liquida (fase diretta con eluizione isocratica o fase inversa con eluizione in gradiente) con rivelazione spttrofotometrica a 306 nm.
Altri due metodi basati sulla gascromatografia prevedono un'estrazione preliminare in fase solida (C18) seguita da, rispettivamente: (1) iniezione diretta del campione su colonna DB-17HT (difenil dimetil polisilossano) e rivelazione in modalità SIM degli ioni a m/z = 228 (M+), 227 ([M-H]+), e 229 (specie contenenti l'isotopo 13C); (2) derivatizzazione con BSTFA con registrazione dei segnali a m/z = 444, 445 e 446 (specie contenenti l'isotopo 30Si). Utilizzando l'iniezione diretta si misurano maggiori quantità di trans-resveratrolo, risultato che è stato attribuito alla parziale decomposizione termica dei glucosidi; al contrario la procedura che include la derivatizzazione tende a sovrastimare l'isomero cis e a sottostimare il trans, probabilmente a causa di un'isomerizzazione da trans a cis. Confrontando invece la GC con la LC si ha che la prima riduce di un fattore 3-4 i tempi di analisi.
Al fine di eliminare le laboriose procedure e gli sprechi di tempo coinvolti nell'estrazione in fase solida è stato proposto di usare la microestrazione in fase solida (SPME): una fibra di poliacrilato con diametro di 85 μm viene immersa direttamente nel vino, la derivatizzazione avviene in fase gas (esposizione della fibra nello spazio di testa dell'agente silante). Con questo metodo i risultati migliorano notevolmente, infatti si raggiungono limiti di rivelabilità di 5 ng/L (2000 volte inferiori a quelli ottenuti con l'SPE) con un range lineare che va da 10 ng/L a 1 mg/L.
Nel 1999 è stato sviluppato un metodo di analisi ESI (electro spray ionization) LC-MS in modalità di ione negativo. Per la cromatografia si utilizza una colonna C18 con eluente metanolo/acetato d'ammonio (55:45 v/v) 20 mM. L'analisi quantitativa è effettuata in modalità SIM con rivelazione dello ione a m/z = 227 ([M-H]-), che a bassi voltaggi (25-35 V) risulta predominante:
Frammentazione del resveratrolo
Spettro di frammentazione del resveratrolo con ionizzazione ESI a basso voltaggio (20-25V)

La preparazione del campione è eseguita tramite SPE a fase inversa. Come standard interno è stato usato il triidrossiflavone a causa dell'elevata efficienza di ionizzazione e delle proprietà idrofobiche comparabili con quelle del resveratrolo. Il limite di rivelabilità è di 200 pg.
In alternativa si può utilizzare la ionizzazione chimica a pressione atmosferica con rivelazione degli ioni positivi. La separazione cromatografica avviene in fase inversa utilizzando come eluente una miscela di metanolo e acido formico: quest'ultimo viene aggiunto alla fase mobile per sopprimere la dissociazione ionica del resveratrolo in colonna dovuta al carattere acido dei gruppi ossidrile. Per la determinazione quantitativa (SIM) si usa lo ione a m/z = 229 ([M+H]+); gli isomeri cis e trans sono misurati con un limite di rivelabilità di 70 pg.