Radiofarmaci a base di Tc

Introduzione

Il 99mTcO-4 può essere usato per ricavare immagini della tiroide, delle ghiandole salivari e della mucosa gastrica ectopica (che si trova cioè in sede diversa da quella normale). Per indirizzare più specificamente il tecnezio verso siti differenti all'interno dell'organismo, tuttavia, è necessario complessare il metallo in maniera tale da condizionarne le proprietà chimico-fisiche.
In base a ciò si distinguono essenzialmente due tipologie principali di radiofarmaci del Tc-99m:

  1. Complessi di coordinazione semplici, i cosiddetti composti essenziali del Tc, il cui destino all'interno dell'organismo è determinato sia dalle caratteristiche chimico-fisiche (carica, taglia, stabilità e lipofilicità) che dalle interazioni con i componenti biologici;
  2. Complessi di coordinazione caratterizzati da un legante con particolari caratteristiche biologiche in grado di coordinare stabilmente il metallo (es. peptidi, anticorpi, molecole a tropismo recettoriale). In questo caso si parla di radiofarmaci marcati con Tc, dove la marcatura deve ovviamente garantire l'inalterazione delle proprietà biologiche.

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Composti essenziali del Tc

Esistono numerosi complessi del Tc impiegati come radiofarmaci.

Radiofarmaci per l'apparato osteoarticolare

Benchè i primi studi scintigrafici siano stati eseguiti utilizzando come radiotracciante l'isotopo 85 dello Stronzio [1], un gamma emittente puro (t1/2 di 64 giorni) con comportamento molto simile a quello del calcio, possiamo fare risalire la diffusione di questo tipo di diagnostica agli inizi degli anni '70, con l'introduzione, da parte di Subramanian e McAfee, dei polifosfati marcati con 99mTc.[2]

Polifosfati
Fig.1 - Alcuni ossoanioni del fosforo: (a) ortofosfato, (b) pirofosfato o dipolifosfato, (c) tripolifosfato, (d) trimetafosfato.

Fig.2 - Anione ortofosfato.[3]

I polifosfati, una volta somministrati per via endovenosa, si legano debolmente alle proteine seriche e vengono rimossi dal circolo ematico per fissazione ossea e per eliminazione renale. Poichè l'attività nell'osso rimane pressochè costante per varie ore, mentre quella del fondo diminuisce lentamente anche in funzione della clearance renale, il rapporto osso/fondo migliore si avrà dopo un certo tempo dalla somministrazione del radiofarmaco. Per migliorare la qualità delle immagini si cercarono altre molecole che mostrassero un comportamento biologico simile a quello dei polifosfati, ma dotate di un migliore rapporto di captazione tra tessuto osseo e fondo. Discreti risultati, in tal senso, si ottennero con i pirofosfati (Fig. 1b), che tuttavia, furono sostituiti ben presto dai 99mTc- difosfonati, per la qualità superiore delle immagini ottenibili.

I difosfonati sono composti organici caratterizzati dal legame P-C-P che, rispetto ai fosfati dotati del gruppo inorganico P-O-P, hanno mostrato una maggiore stabilità in vivo, in quanto sui primi non è attivo l'enzima fosfatasi (idrolasi che catalizza la rimozione di gruppi fosfato) ed inoltre i difosfonati, presentando un minor riassorbimento tubulare (riassorbimento dei soluti a livello dei reni) rispetto ai fosfati, mostrano una eliminazione renale della loro frazione circolante più veloce, che consente di ottenere una buona qualità delle immagini, anche dopo tempi nettamente più brevi dalla somministrazione. Il miglior rapporto tra l'attività ossea e l'attività nei tessuti molli si ottiene circa 3 ore dopo l'iniezione. Tale tempo può risultare più lungo, in caso di ridotta funzione renale.

Bisfosfonato

Fig.3 - Formula generica del difosfonato.

Tra questi composti i metildifosfonati (MDP) sono quelli più utilizzati. Poichè i fosfonati sono agenti chelanti piuttosto deboli e tendono a degradarsi sotto l'azione di ossidanti dando di nuovo origine alla formazione di pertecnetato, nel kit di marcatura è necessaria la presenza, oltre ad una certa quantità di Sn2+, di agenti stabilizzanti quali l'acido ascorbico o gentisico che prevengono la formazione di stagno idrossido colloidale. Quando immesso nel kit di preparazione, il 99mTc pertecnetato viene ridotto dallo stagno dalla valenza +7 a +4 potendo così legarsi al difosfonato. Il ruolo dello stagno, in questo caso, è particolarmente importante, non solo per la sua attività di riducente ma anche perchè lo Sn4+ che si forma durante l'ossidoriduzione del pertecnetato, forma delle specie polimeriche Tc(DP)-Sn(DP) tutte dotate di elevatissima affinità per il tessuto osseo.





Fig.4 - La rappresentazione bidimensionale del 99mTc-(Sn)-MDP
(o 99mTc-Medronate) e il legante metilendifosfonato (3D). [4]

Il principale meccanismo di legame dei fosfati e dei fosfonati sull'osso è il chemioadsorbimento (o chemisorzione), che avviene per mezzo di legami chimici nelle regioni di flessione e di dislocazione sulla superficie dei cristalli di idrossiapatite, Ca5(PO4) 3(OH) o Ca10(PO4)6(OH)2, come di solito si scrive per evidenziare che la cella elementare è formata da due molecole.
Lo stagno e il 99mTc vengono idrolizzati e si legano all'osso o separatamente o assieme sotto forma di idrossido di stagno e diossido di tecnezio. Le grandi superfici di idrossiapatite idratata, presenti ad esempio nei centri di crescita o nelle lesioni ossee metabolicamente attive, permettono un maggiore chemioadsorbimento e quindi mostrano maggiore capacità di concentrare il radiofarmaco. Ciò porta alla questione riguardante l'incremento della fissazione assea (uptake) del radiofarmaco nelle aree interessate da fenomeni patologici:

Il legante metilendifosfonato si sintetizza a partire dalla reazione tra il bromuro di metilene e il triisopropilfosfito. Il prodotto che si ottiene è il tetraisopropil estere di MDP. I gruppi isopropilici vengono dunque idrolizzati tramite aggiunta di HCl da cui si ottiene prima l'acido metilendifosforico e poi, in seguito alla neutralizzazione con NaOH, il sale corrispondente.[6]
Trialchilfosfito

La struttura allo stato solido del complesso Tc-MDP consiste d'infinite catene polimeriche. Ogni legando MDP fa da ponte tra due atomi di tecnezio simmetricamente disposti (Fig.5) e ogni atomo di tecnezio è a sua volta legato a due molecole di legando (Fig.6). Il rapporto MDP/Tc nel polimero è dunque di 1/1.

Fig.5 - Vista in prospettiva di una porzione della struttura del composto {[Li(H20)3][Tc(OH)-(MDP)]*1/3H20}n. L'immagine mostra una molecola di legando MDP che coordina due atomi di Tc.
Una molecola di legando MDP che coordina due atomi di Tc. Un atomo di Tc legato a due molecole di MDP.
Fig.6 - Vista in prospettiva di una porzione della struttura del composto {[Li(H20)3][Tc(OH)-(MDP)]*1/3H20}n. L'immagine mostra un atomo di Tc legato a due molecole di MDP.

L'unità ripetitiva del polimero è completata da un atomo di ossigeno (presumibilmente in forma di ione ossidrile) - che si mette a ponte tra due atomi di Tc disposti in maniera simmetrica (Fig.5) - e da un catione idrato di Li+ che neutralizza la carica negativa associata all'unità ripetitiva. Infine c'è un singolo atomo di ossigeno (probabilmente associato ad una molecola d'acqua) collocato lungo l'asse di rotazione ternaria del gruppo spaziale. Ciascun atomo di Tc ha coordinazione ottaedrica con i due atomi di ossigeno a ponte in cis.
La principale caratteristica strutturale del Tc-MDP risiede nella sua natura polimerica: pare infatti che proprio questa giochi un ruolo centrale nella chimica di tale agente d'imaging scheletrico.[7]

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Radiofarmaci per l'apparato polmonare

La visualizzazione scintigrafica dei polmoni può essere ottenuta con due diverse tecniche:

  1. Iniezione endovenosa di particelle radioattive che, per le loro dimensioni, si arrestano a livello della rete arteriolo-capillare dei polmoni. Le relative immagini rappresentano una mappa della perfusione sanguigna polmonare, di cui mettono in evidenza ogni alterazione massiva o regionale (es. embolia polmonare), indipendemente dalla causa che la produce.
  2. Inalazione di materiali radioattivi in forma di gas o di aerosol, capaci di distribuirsi fino alle ultime diramazioni dell'albero respiratorio. Le immagini che si ottengono con questo procedimento, detto appunto scintigrafia d'inalazione, offrono una rappresentazione visiva della ventilazione nei vari distretti polmonari e ne possono evidenziare alterazioni globali o settoriali consecutive ai processi patologici di varia natura (es. patologie bronchiali ostruttive).

L'indagine ventilatoria, in particolare, ha acquisito molta importanza soprattutto negli ultimi tempi. Si tratta di una tecnica non invasiva, del tutto scevra di rischi per il paziente. Per eseguirla è sufficiente che il paziente respiri all'interno di una mascherina. I radiofarmaci, a seconda della loro natura chimico-fisica, vengono eliminati con l'espirazione, per escrezione renale o per trasporto mucocialiare fino all'apparato gastroenterico. La dose di radiazioni assorbita dai polmoni è bassa e così anche la dose di radiazioni assorbita dalle gonadi e dal corpo intero.

La necessità di disporre in qualsiasi momento, per indagini a carattere di urgenza, di un tracciante per studi di ventilazione polmonare, ha fatto entrare nell'uso clinico gli aerosol marcati con 99mTc che vengono prodotti nebulizzando il 99mTc-DTPA.
L'acido dietilen-triamino-pentacetico (DTPA) è una molecola organica, di peso molecolare minore di 500 dalton, solubile e stabile a pH fisiologico, appartenente ad una classe di complessanti detti chelanti per la forte capacità che hanno di trattenere cationi metallici senza per questo modificare il loro comportamento chimico.





Fig.7 - DTPA, acido dietilentriaminopentacetico.[8]

Ancora oggi risulta sconosciuta la struttura fisica del complesso 99mTc-DTPA. Lo stato di ossidazione del metallo in questo complesso sembra sia uguale a +5. La coordinazione del legante al 99mTc avviene tramite gli atomi di ossigeno e di azoto, mentre almeno due gruppi carbossilici rimangono non coordinati. Proprio l'esistenza di questi gruppi non coordinati sembra costituire un fattore importante del comportamento biologico del tracciante.

Gli aerosol presentano il vantaggio, rispetto ai gas, di una maggiore disponibilità e più facile utilizzazione. Il procedimento per ottenere l'aerosol consiste nell'immettere circa 3 ml di 99mTc-DTPA, ad attività di 370MBq/ml, nell'apposito nebulizzatore attraverso il quale viene fatta passare forzatamente aria o ossigeno dando così origine ad una nebbia che viene inalata dal paziente. L'aerosol è caratterizzato per lo più da particelle comprese tra 500 e 800 nm di diametro che si comportano, nell'albero bronchiale, come un gas durante l'inalazione, mentre la distribuzione di quelle superiori a 1000 nm è influenzata dalle dimensioni delle particelle stesse. Il 99mTc-DTPA viene assorbito attraverso l'epitelio alveolare polmonare, entra nel circolo sanguigno da dove viene filtrato a livello dei reni e rapidamente escreto. L'emivita biologica nel soggetto normale è attorno a 50 minuti e risulta ridotta in soggetti affetti da patologie che compromettono l'interstizio polmonare. Il ritmo della clearance (cioè il volume di sangue o di plasma dal quale i reni sono in grado di eliminare una certa sostanza nell’unità di tempo) del 99mTc-DTPA inalato, rappresenta infatti un indice della permeabilità epiteliale del polmone. Nello specifico, un incremento della permeabilità dell'epitelio polmonare, risultante da un'infiammazione o da cause di altro genere, porta ad un aumento del ritmo di clearance del radiofarmaco. [9]

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Radiofarmaci per l'apparato cardiovascolare

I principali radiofarmaci gamma emittenti, proposti per indagini cardiache, possono essere suddivisi in:

-Traccianti di perfusione miocardica: 201 TI-Cloruro; 99mTc- Teboroxime; 99mTc-sestaMIBI; 99mTc-Tetrafosfima; 99Tc-Q12

-Traccianti di metabolismo miocardico: I-123 Acidi grassi;

-Traccianti per la localizzazione di infarto miocardico: Tc-99m Pirofosfato, Tc-99m Glucarato, In-111 Anticorpi Antimiosina;

-Traccianti per lo studio dell'innervazione cardiaca simpatica: I-123 MIBG.

Tra questi, ci soffermeremo solo sui traccianti di perfusione miocardica tecneziati e in particolare sul 99mTc-sestaMIBI, più comunemente chiamato Cardiolite, tralasciando per motivi di brevità, la descrizione degli altri radiofarmaci, attualmente di minore importanza clinica[10].




In questo complesso lo ione Tc+ si trova al centro di una struttura a simmetria ottaedrica ed è legato a sei leganti monodentati CNR per formare il catione stabile [99mTc-(CNR)6]+. La sintesi di questo composto ha rappresentato una tappa molto importante nello sviluppo della medicina nucleare.


Sintesi del complesso [Cu(MIBI)4]BF4:[11]
In una beuta di vetro pirex raffreddata con un condensatore di ghiaccio asciutto il 2-metil-propenilammina colroidrato(5.35 g-
50mmol) e la formammide (3.38g-70mmol) vengono mescolati e irradiati al centro di un forno a microonde domestico a 240W per
25 secondi. La beuta viene calata in un bagno d'acqua, vengono addizionati 10 mL di CHCl3, la miscela viene filtrata e la fase solida
viene lavata con 5 mL di CHCl3. Il filtrato viene concentrato un evoaporatore rotante, il prodotto grezzo va distillato a pressione
ridotta (0,9 mmHg), ed il prodotto, raccolto a 72-6°C, ha una resa di 3.36g (68.0%)

Tc-99m Sestamibi.[12]

Il sesta-MIBI o metossi isobutil isonitrile appartiene ad un gruppo di radiofarmaci oncotropi cationici lipofili che derivano da complessi isonitrilici, marcati con 99mTc, utilizzati primariamente per lo studio della perfusione miocardica e, dagli anni '90, in campo oncologico. Quindi il MIBI è un complesso cationico lipofilico, che legato al 99mTc, è largamente utilizzato, per le sue caratteristiche di biodistribuzione, negli studi di perfusione miocardica.

L'uptake nelle cellule tumorali è correlato alla perfusione e soprattutto all'intensità del gradiente elettrico transmembrana che riflette la vitalità cellulare. Il meccanismo di uptake e la ritenzione del MIBI nei mitocondri di cellule neoplastiche è stato studiato in modelli in vitro. E' evidente una maggiore concentrazione nelle cellule tumorali maligne rispetto a quelle normali.

Il MIBI penetra reversibilmente nel citoplasma, grazie alla sua lipofilicità, utilizzando una ddp transmembrana citoplasmatica (∆Ѱc) e quindi passa irreversibilmente nel mitocondrio per la presenza di un gradiente elettrico (∆Ѱm) generato da più elevato potenziale elettrico negativo situato all'interno del mitocondrio. La differenza di gradiente elettrico ∆Ѱ( ∆Ѱc+∆Ѱm) dall'esterno delle cellule ai mitocondri fra cellule epiteliali normali e cellule di carcinoma è uguale a 60 mV e questo favorisce l'accumulo di farmaci lipofilici.

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Radiofarmaci per lo studio del sistema nervoso centrale


I radiocomposti fino ad ora impiegati per indagini diagnostiche celebrali possono essere suddivisi in traccianti diffusibili e non diffusibili, a seconda che abbiano la capacità di attraversare la barriera ematoencefalica (BEE) intatta.
Traccianti non diffusibili: sono essenzialmente radiofarmaci composti da ioni o molecole polari che non riescono ad attraversare la barriera ematoencefalica integra. Un loro accumulo cerebrale, quindi, rappresenta un indice di vascolarizzazione della lesione e di alterazione della permeabilità della barriera stessa. Appartengono a questa classe: 99mTcO4, 99mTc-DTPA, 99mTc-Gluconato, 201TI-Cloruro, 99mTc sestaMIBI. Su questa classe di radiocomposti non ci soffermeramo per il loro attuale impiego diagnostico.
Traccianti diffusibili: sono radiocomposti in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. In genere le molecole essenziali entrano nel cervello per trasporto attivo, ma anche molecole neutre, lipofiliche e di perso molecolare inferiore ai 500-700 daltons, possono attraversare la barriera ematoencefalica intatta per diffusione passiva. In base quindi al loro meccanismo di localizzazione, i traccianti diffusibili celebrali possono essere suddivisi in due categorie:
- Traccianti di perfusione che si distribuiscono nel tessuto cerebrale in quantità proporzionale al flusso ematico;
- Traccianti recettoriali che si localizzano attraverso l'interazione con recettori specifici. La loro distribuzione è quindi più elevata in quelle aree del cervello che esprimono selettivamente i recettori bersaglio.

Studio della perfusione celebrale; Utilizzato per la marcatura di cellule


99mTc-HM-PAO.[13a]

Il complesso 99mTc-HM-PAO è formato da un atomo di Tc, nello stato di ossidazione +5, legato ad un atomo di ossigeno terminale, ed ai quattro atomi di azoto del legante HM-PAO. Tramite la chiusura ad anello del legante HM-PAO, dovuta all'instaurarsi di un legame ad idrogeno fra i gruppi idrossilici dell'ossima, si forma un complesso finale con carica nulla. La geometria molecolare risultante è piramidale a base quadrata, dove il gruppo Tc=O occupa la posizione apicale. La sintesi del 99mTc-HM-PAO può dare origine a due isomeri conformazionali (indicati con i termini meso e d,l rispettivamente), che differiscono nella posizione relativa hai gruppi metilici (CH 3) posti sull'anello del legante HM-PAO. L'isomero meso possiede un'immagine speculare (la configurazione che si ottiene riflettendo la geometria molecolare del complesso in uno specchio) perfettamente sovrapponibile all'immagine iniziale.Viceversa, le immagini speculari dell'isomero d,l non sono sovrapponibili, per cui questa forma isomerica si presenta, in realtà, sottoforma di due isomeri ottici separati (indicati appunto con le lettere d e l). La forma attiva del tracciante è costituita proprio dalla miscela dei due antipodi ottici d e l che vengono trattenuti nel tessuto cerebrale per un lungo tempo, mentre l'isomero meso viene rapidamente eliminato. la denominazione completa di questo agente cerebrale è quindi 99mTc-d,l HM-PAO.E' stato osservato che, dopo la preparazione, la specie 99mTc-d,l HM-PAO si trasforma in vitro in un composto secondario la cui lipofilicità risulta notevolmente diminuita. Sebbene la natura del complesso secondario, idrofilico, non sia mai stata determinata, la stessa osservazione ha permesso di formulare una possibile spiegazione sulla distribuzione di questo radiofarmaco. Infatti, si è ipotizzato che la conversione del composto 99mTc-d,l HM-PAO nella specie idrofilica avvenga anche in vivo, seppure molto più rapidamente in quanto attivata dall'azione del glutatione presente nei tessuti; una volta poi trasformatosi nel composto idrofilico, il tracciante non riuscirebbe più a riattraversare la barriera emato-encefalica rimanendo, quindi, all'interno del parenchima cerebrale.
A causa della limitata stabilità in vitro, la purezza radiochimica di questo radiofarmaco risente fortemente di vari fattori legati sia alla qualità della soluzione di pertecnetato utilizzata per la sua preparazione, sia al rapporto 99mTcO4-/99TcO4-. Viene consigliato, quindi, di utilizzare non più 1.11 GBq di 99mTcO4- eluito da non più di due ore e ottenuto da un generatore già eluito nelle 24 ore precedenti. Inoltre, il radiofarmaco deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla preparazione. In alcuni paesi il prodotto è reperibile unito ad una fiala contenente blu di metilene che conferisce una maggiore stabilità in vitro al complesso.

Negli anni che seguirono l'introduzione del composto 99mTc-HM-PAO fu sviluppato un secondo agente di perfusione cerebrale, utilizzando una classe di leganti del tecnezio completamente diversa, costituita dai derivanti del diamminoditiolo (DADAT). Il nuovo tracciante , 99mTc-ECD (o 99mTc-Bicisato o Neurolite), fu ottenuto legando al gruppo Tc=O il derivato diestere ECD, costituito da due residui cisteinici collegati da un ponte etilenico. Nel complesso neutro risultante, l'atomo di Tc è legato a due atomi di zolfo deprotonati e a due atomi di azoto, dei quali solamente uno ha perso un protone. La geometria molecolare risultante è piramidale a base quadrata, dove il gruppo Tc=O occupa la posizione apicale.



99mTc-ECM .[13b]


Il 99mTc-ECD preso da noi in considerazione, possiede caratteristiche chimico fisiche che gli permettono di attraversare la barriera ematoencefalica per diffusione passiva. Successivamente ,il tracciante subisce un processo di idrolisi enzimatica e rimane così trattenuto nel tessuto celebrale, essendo stato possibile stabilire che, subito dopo la captazione, il complesso 99Tc-ECD viene trasformato nella specie carica negativamente 99mTc-ECM, attraverso l'azione degli enzimi esterasi presenti nelle membrane cellulari e, di conseguenza, il complesso risultante non può più riattraversare la barriera emato-encefalica.

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Radiofarmaci per l'apparato urinario

Traccianti di scintigrafia renale statica
I radiofarmaci per lo studio del rene possono essere suddivisi in traccianti per scintigrafia renale statica e traccianti per scintigrafia renale sequenziale. Tra i primi ricordiamo, il 99mTc-DSMA, mentre tra i secondi lo 131I-Ippurano, il 99mTc-DTPA e il 99mTc-MAG.

Il 99mTc-Betiatide o MAG3 preso da noi in considerazione detto comunemente MAG3 è il risultato di studi sulla sintesi di complessi del tecnezio con leganti tetradentati contenenti atomi di azoto e zolfo come siti coordinanti. In particolare, furono Fritzberg e collaboratori che proposero il sistema N3S ( 3 atomi di azoto e 1 di zolfo) come gruppo coordinante, introducendo il legante MAG3. Il prodotto diagnostico è costituito da un procursore benzoil-MAG3 mescolato a tartrato di sodio e cloruro stannoso; il complesso 99mTc-MAG3 si ottiene facendo reagire il pertecnetato in presenza di cloruro stannoso. Nella reazione, il gruppo benzoilico ,che protegge l'atomo di zolfo, viene rimosso assieme ai protoni legati agli atomi di azoto dando origine ad un complesso anionico di geometria piramidale a base quadrata, in cui lo ione Tc5+ è legato ad un atomo di ossigeno terminale, posto all'apice della piramide, all'atomo di zolfo e ai tre atomi di azoto del legante MAG3 posti sul piano di base della piramide.

Il gruppo carbossilico (-COOH) laterale non coordinato sembra anche in questo caso avere un ruolo importante nell'accelerare l'escrezione urinaria. Il procedimento di marcatura richiede il riscaldamento della soluzione di reazione, a bagnomaria e a 100°C per rimuovere il gruppo benzoilico a protezione dell'atomo di zolfo contenuto nel sistema chelante N3S. Questo radiofarmaco presenta un comportamento analogo a quello dello Ippurano, caratterizzato da un'elevata eliminazione tubulare, cosicchè dopo 3 ore oltre il 90% dell'attività iniettata viene eliminata, mentre un'attività residua rimane nel fegato, nella colecisti e nell'intestino. La captazione in queste aree è indipendente dalla funzionalità renale, ed è attribuibile alle proprietà lipofiliche del complesso 99mTc-MAG3. Inoltre l'estrazione renale, 2-3 volte superiore a quella del complesso 99mTc-DTPA, consente misure accurate anche in pazienti in cui la funzione renale è molto compromessa.

99m-Tc-MAG3.[13c]


Biocomposti marcati con Tc

Negli ultimi anni sono stati molto studiati e sperimentati i cosiddetti radiofarmaci target-specifici. Essi derivano dalla marcatura di biomolecole che presentano alta affinità e selettività per siti biologici implicati in forme patologiche e che svolgono la funzione di veicolare il radionuclide (molecola direzionatrice).
A differenza di isotopi di atomi naturalmente presenti nelle molecole biologiche (O, C, N), che possono essere incorporati nelle molecole direzionatrici attraverso la formazione di un legame covalente, gli isotopi di natura metallica, come il 99mTc, devono essere stabilizzati da un sistema chelante. Nell’ultimo decennio è stata sviluppata un’ampia gamma di tecniche per la marcatura di biomolecole con radiometalli, ma la metodica più ampiamente studiata e impiegata consiste nell’approccio con un chelante bifunzionale (Bifunctional Chelating Agent, BFCA). Il chelante bifunzionale presenta da un lato un set coordinativo in grado di stabilizzare il metallo, dall’altro un gruppo funzionale per l’ancoraggio covalente della biomolecola, che può essere diretto oppure mediato da uno spaziatore (linker), a dare il derivato BFCA(-linker)-BM. La scelta accurata del BFCA è uno degli aspetti fondamentali nella progettazione di radiofarmaci target-specifici. Un BFCA ideale dovrebbe garantire la formazione di un complesso con alta resa e a concentrazioni molto basse del coniugato BFCA-BM. Tale complesso non dovrebbe sottostare a reazioni di ossidoriduzione, dovrebbe essere termodinamicamente stabile e cineticamente inerte e presentare un basso numero di isomeri, in quanto tutti questi parametri possono influenzare notevolmente le caratteristiche biologiche farmacocinetiche del coniugato BFCA-BM. Infine, l’attacco del BFCA alla biomolecola dovrebbe essere facilmente realizzabile. La selezione del BFCA dipende dal tipo di radiometallo e dal suo stato di ossidazione.

Il core [M=O]3+ viene largamente impiegato per la marcatura di biomolecole con 99mTc e negli ultimi 15 anni sono stati sintetizzati e valutati molti chelanti bifunzionali, la maggior parte dei quali possiede un set coordinativo di tipo NxS(4-x). Tra questi, particolarmente interessanti sono i sistemi legandi diamideditiolato (N2S2, DADS), i cui complessi con Tc (Fig.8 e Fig.9) hanno tra l'altro rivelato, già di per sè, ottime qualità come radiofarmaci per l'imaging renale [13d]:

Strutture di alcuni Tc-DADS, un gruppo di radiofarmaci marcati con Tc impiegati per l'imaging renale

Fig.8 - Strutture di alcuni Tc-DADS.


Fig.9 - Esempio di complesso chelato di tipo
99mTc-CO2-DADS.

Un complesso Tc-99m DADS è preparato a partire dall'estere di benzoato corrispondente al legando scelto:
Precursori dei composti DADS con i solfidrili protetti da gruppi benzoilici Fig.10 - Precursori dei composti DADS con i solfidrili protetti da gruppi benzoilici. DADS ("diaminodisulfhydryl") N,N'-bis(S-benzoilmercaptoacetil) etilendiamina; CO2-DADS* ("carboxy-DADS") etil-N,N'-bis(S-benzoilmercaptoacetil)-2,3-diaminopropanoato; P-DADS ("propylene-DADS") N,N'-bis(S-benzoilmercaptoacetil) propilendiamina; AP-DADS("asymmetric propylene-DADS") N-[N'-(S-benzoilmercaptoacetil-alanil)]-S-benzoilmercaptoetil amina; CAP-DADS* ("carboxy asymmetric propylene DADS") S-benzoilmercaptoacetil-alanil-S-benzoil-L-cistein etil ester; [*isomeri geometrici in seguito alla marcatura].
esso dev'essere idrolizzato per ottenerne la forma solfidrilica prima della marcatura. La reazione d'idrolisi avviene a caldo in una miscela di etanolo e NaOH alla quale vengono in seguito aggiunti la soluzione salina di pertecnetato e il riducente SnCl2 per la marcatura. [14]
I chelati sono tipicamente tetradentati e formano complessi molto stabili col Tc(V), caratterizzati da struttura piramidale a base quadrata.

Il sistema legando di tipo CO2-DADS è stato impiegato, ad esempio, nella marcatura di frammenti di anticorpi con 99mTc.
La presenza del gruppo carbossilato, potenzialmente legante ma che non partecipa alla coordinazione del metallo, offre infatti la possibilità di marcare la biomolecola tramite semplice coniugazione con il complesso 99mTc-DADS (previa conversione chimica del carbossilato in estere attivo).

Fig.11 - Sintesi del composto 99mTc-N2S2- anticorpo tramite (i) formazione del 99mTc-4,5-bis(tioacetamide)pentanoato, (ii) conversione di quest'ultimo nell'estere attivo 2,3,5,6-tetrafluorofenile per reazione con il fenolo e una carbodiimide solubile in acqua e infine (iii) coniugazione con l'anticorpo mediante acilazione dell'amino-gruppo.
Sintesi del composto 99mTc-DADS-anticorpo

Le valutazioni effettuate sui composti 99mTc-N2S2-anticorpo ne hanno evidenziato le importanti caratteristiche di elevata stabilità e inalterata immunoreattività. [15]

Questi chelanti, sebbene abbiano trovato applicazione, soffrono di alcune limitazioni quali l’elevata lipofilia, una bassa flessibilità strutturale, più forme isomeriche spesso difficili da separare e talvolta anche limitata stabilità in vivo. Inoltre la loro marcatura richiede spesso condizioni drastiche. Lo sviluppo di BFCA più efficienti resta quindi uno degli interessi principali nell’ambito della medicina nucleare.

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Peptidi marcati con Tc

Un altro aspetto rilevante nella progettazione di radiofarmaci target-specifici è la scelta della biomolecola direzionatrice. Piccoli peptidi sono ampiamente considerati in quanto offrono alcuni vantaggi, quali elevata affinità per uno specifico recettore, bassa immunogenicità, elevata clearance plasmatica, resistenza a condizioni di marcatura abbastanza drastiche. Numerosi sono i peptidi che sono stati marcati con Tc usando legandi tetradentati del tipo NxS(4-x). Poichè vi sono differenti residui amminoacidici in grado di legare il tecnezio, è essenziale che la struttura di tali composti, usati come radiofarmaci, sia determinata senza lasciare spazio ad ambiguità di alcun genere. Sebbene la tacnica di diffrazione a raggi X sia la più indicata in questi casi, la maggior parte dei peptidi marcati non forma cristalli singoli; in alternativa, la spettroscopia multi-NMR si è dimostrata essere uno strumento molto utile per l'analisi strutturale.

Un esempio recente di tale lavoro di caratterizzazione dei radiofarmaci di tipo Tc-peptide è stato riportato da Giblin e dai suoi collaboratori. [16] Dei composti analoghi all'a-Melanocyte Stimulating Hormone (a- MSH) - ciclizzati attraverso la coordinazione, in corrispondenza di siti specifici, di atomi metallici quali il renio (Re) e il tecnezio (Tc) - sono stati caratterizzati e analizzati per la loro capacità di legarsi ai recettori dell'a-MSH presenti sulle cellule di melanoma di ratto e umane. Da questo e dall'eccezionale stabilità in vivo di tali composti deriva la possibilità d'impiegarli come radiofarmaci nel melanoma-imaging o a scopo terapeutico. L'80% dei campioni studiati di melanoma umano, dotati dei recettori specifici per l'a-MSH, consente infatti l'uso di composti marcati, analoghi dell'a-MSH, come agenti diagnostici e terapeutici specifici per tale tipo di tumori.

L'a-Melanocyte Stimulating Hormone è un tridecapeptide [Ac-Ser1-Tyr2-Ser3 -Met4-Glu5-His6 -Phe7-Arg8-Trp9 -Gly10- Lys11-Pro12-Val13 -NH2] che regola la pigmentazione della pelle nella maggior parte dei vertebrati. La sequenza centrale dell'a-MSH, His-Phe-Arg-Trp, che si conserva tal quale in molte specie, è sufficiente per il riconoscimento da parte del recettore.

alpha-MSH

Fig.12 - alpha-MSH.[17]


Sono stati sintetizzati diversi composti analoghi dell'a-MSH in maniera tale da incrementarne sensibilmente le caratteristiche di affinità per il recettore e di stabilità. In particolare, è stato segnalato il caso dei peptidi a-MSH ciclizzati tramite ponte disolfuro [Cys4,10, D-Phe7]-alpha-MSH (= Ac-Ser1-Tyr2- Ser3-Cys4-Glu5 -His6-Phe7-Arg8 -Trp9-Cys10-Lys11 -Pro12-Val13-NH2). [18]
APOMSH

Fig.13 - N-Acetyl- [Cys4,10, D-Phe7]-alpha-Melanocyte Stimulating Hormone Fragment- 4-13, APOMSH. [19]
Proprio l'analogo ciclico dell'a-MSH riportato in Fig.13, (Cys4,10, D-Phe7)–a- MSH4-13 (APOMSH) ha costituito il punto di partenza delle analisi effettuate da Giblin e i suoi collaboratori. Come metodo per la sintesi proteica è stata sfruttata la tecnica standard di sintesi in fase solida basata sulla chimica del fluorenilmetossicarbonile (Fmoc).
La metodologia di sintesi “in fase solida” prevede di ancorare la catena peptidica in crescita, attraverso il gruppo carbossilico del primo amminoacido, ad un supporto polimerico non solubile. In questo modo, il polipeptide rimane “agganciato” al supporto per l’intera durata dei cicli di sintesi, permettendo di sostituire le operazioni di purificazione intermedie con semplici lavaggi e filtrazioni. Data poi la ripetitività delle operazioni previste per condensare un amminoacido all’altro, risulta possibile automatizzare il processo con un notevole risparmio di tempo ed una più elevata riproducibilità. Al termine della sintesi, il polipeptide viene allontanato dal supporto e vengono contemporaneamente rimosse le protezioni introdotte nei gruppi in catena laterale.[20]
Lo schema successivo riassume gli stadi della sintesi proteica in fase solida:

Schema di sintesi proteica in fase solida

Tra i gruppi più comunemente utilizzati per la protezione del terminale amminico vi è il fluorenilmetossicarbonile:





Fig.14 - Fluorenilmetossicarbonil
cloruro.[21]



Fluorenilmetossicarbonil

Fig.15 - Fluorenilmetossicarbonile.

Incorporando dunque, nel peptide APOMSH così ottenuto, un core di Tc/Re(V)O, sono stati ottenuti i corrispondenti complessi 99mTc/ 188Re-[Cys4,10, D-Phe7]-alpha-MSH4-13 ( 99mTc/ 188Re-MSH). Per l'analisi strutturale di tali radiofarmaci sono stati tenuti in considerazione due elementi molto importanti riguardo le caratteristiche della coordinazione dei due metalli:
  • Entrambi Tc e Re, quando si trovano in stato di ossidazione +5, assumono una geometria di coordinazione di tipo piramidale a base quadrata: gli atomi donatori si posizionano ai vertici della base mentre l'ossigeno del core [MeO]3+ si trova in corrispondenza dell'apice della piramide;
  • Sperimentalmente entrambi mostrano una certa preferenza per specifici atomi donatori (es. S>N>>O).
Nello specifico, per la caratterizzazione strutturale, è stato impiegato il ReMSH. Il Renio è stato introdotto in un campione pre-ridotto di APOMSH tramite un processo di transchelazione a partire da ReOCl3(Me2S)(OPPh3). La spettroscopia di massa ha restituito un valore di peso molecolare per il complesso metallo-peptide che conferma l'ipotesi di un rapporto di 1/1 tra le due parti [m/z (M + H)+ osservato = 1546; calcolato = 1544.8]. Dagli studi NMR si è inoltre evidenziata la scomparsa, rispetto al peptide libero dal metallo, dei due protoni amidici appartenenti alle unità Trp-9 and Cys-10. Questi risultati hanno suggerito l'ipotesi che il tiolato del Cys-10 e i due atomi azoto dei due gruppi amidici che lo precedono si posizionino su tre vertici della base quadrata di atomi donatori. Le alterazioni nel chemical-shift dei protoni
n hanno rivelato che il quarto atomo donatore che entra a far parte della sfera di coordinazione del Re è lo zolfo tiolato del Cys-4.

Fig.16 - ReMSH [22]

La coordinazione del metallo, nel ReMSH, include quindi anche il Trp, che fa parte della sequenza di riconoscimento dell'a-MSH da parte del suo specifico recettore, e ciò ha comportato il rilevamento di un notevole decremento dell'affinità tra i due sistemi. Inoltre è stato posto l'accento sulla scarsa stabilità di tale tipo di complessi, che risulta ancora più accentuata nel caso del 99mTcMSH.

99mTc-CCMSH

Fig.17 - 99mTc-CCMSH.

Valori più significativi di uptake tumorale sono stati ottenuti per il radiofarmaco 99mTc/ 188Re-[(Cys3,4,10, D-Phe7)–a-MSH3-13] (o 99mTc/ 188Re-CCMSH). Il CCMSHè un peptide a 11 aminoacidi [Acetyl-Cys-Cys-Glu-His-dPhe-Arg-Trp- Cys-Lys-Pro-Val-NH2] - contenente un residuo Cys (Cys-3) in più rispetto all'APOMSH, in corrispondenza dell'N-terminale - che viene ciclizzato in seguito alla coordinazione del metallo.

Per il complesso così formato è risultato nuovamente un rapporto di 1/1 tra metallo e peptide [analisi MS: m/z (M + H)+ osservato = 1648.1, calcolato = 1647.9]. Dalla caratterizzazione NMR si è rilevato invece che, questa volta, un solo protone amidico, l'1H del Cys-4, viene perso in seguito alla complessazione; mentre l'assenza di tioli liberi nel complesso peptide-metallo ha suggerito che tutti i Cys-tiolati del peptide partecipino alla coordinazione del core MeO.

L'ipotesi di partenza per la sintesi di questo secondo tipo di composti analoghi dell'a-MSH era che, vista la maggiore affinità del Tc e del Re per lo zolfo, come atomo donatore, rispetto all'azoto, l'aggiunta di un nuovo gruppo tiolato potesse allontanare la sfera di coordinazione del metallo dalla sequenza di core His-D-Phe-Arg-Trp. In effetti i risultati dell'analisi strutturale le hanno dato ragione. Ciò ha consentito non solo di mantenere inalterata la specificità del composto verso il suo recettore, ma anche di trarre un guadagno notevole in termini di stabilità del radiofarmaco, con conseguenti maggiori possibilità d'impiego dello stesso sia in campo diagnostico che in ambito terapeutico.

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Bibliografia

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