Tecniche di analisi

Le tecniche di analisi delle diossine e dei composti diossino-simili più utilizzate sono le seguenti:
Saggio CALUX

Il biosaggio CALUX è uno strumento bioanalitico che viene sempre più utilizzato nella ricerca e nei laboratori commerciali per lo screening e la quantificazione di diossine e composti diossino-simili nel sangue [33][34][35][36], nei sedimenti[37][38][39][40], nelle matrici alimentari[41][42][43][44], e nel latte[45][46]. Questo strumento di screening, più economico e più rapido dei convenzionali strumenti chimici di analisi delle diossine, è fondamentale per l’analisi dell’ alto numero di campioni richiesta per la sicurezza alimentare[47] e per il monitoraggio ambientale.
Il CALUX è un biosaggio cellulare che utilizza cellule geneticamente modificate le quali rispondono a sostanze chimiche che attivano il recettore per gli idrocarburi arilici (AhR). L’effetto comune che risulta dall’attivazione del recettore AhR nelle cellule è l’induzione dell’espressione genica e questo costituisce la base del biosaggio. Le cellule ricombinanti utilizzate nel CALUX permettono infatti l’induzione dell’espressione del gene della luciferasi in seguito al legame del recettore AhR con sostanze chimiche in grado di attivarlo. L’ammontare dell’attività della luciferasi indotta è direttamente proporzionale alla quantità e alla potenza della sostanza chimica inducente alla quale la cellula è stata esposta[48][49]. La luminescenza misurata è convertita in un valore di tossicità equivalente di biosaggio (CALUX-TEQ) attraverso il confronto diretto del responso ottenuto per un dato campione con una curva dose-risposta ottenuta con la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD).
Poiché le analisi CALUX forniscono risposta biologica a tutti i composti AhR attivi presenti in un dato campione, l’interpretazione dei risultati è significativamente più complessa di altre analisi chimiche. Gli operatori in laboratorio possono regolare molti parametri quando eseguono le analisi CALUX e la procedura applicata può influire fortemente sui risultati e, quindi, sull’interpretazione dei risultati. C’è un vasto numero di laboratori che utilizzano tale tecnologia come anche vi sono diverse tipologie di cellule per saggi CALUX e, sebbene siano stati descritti alcuni metodi utilizzati dai maggiori gruppi di ricerca, non esiste un metodo comunemente accettato per questa analisi. Inoltre non vi sono pubblicazioni che abbiano valutato sistematicamente l’influenza di ciascun aspetto della metodologia CALUX sulla qualità dei risultati. Nello sforzo di superare tali difficoltà, i fornitori commerciali delle linee cellulari CALUX hanno proposto procedure operative standard (SOP) per le differenti matrici. Sebbene gli studi di intercalibrazione tra laboratori diversi rivelano che i risultati del saggio su campioni identici sono dello stesso ordine di grandezza, sono state osservate differenze significative nella riproducibilità e nella ripetibilità.

Può il saggio CALUX essere considerato un sostituto per la GC-MS ad alta risoluzione?
Sebbene i valori TEQ derivati dal biosaggio CALUX e dalla GC-MS ad alta risoluzione siano risultati relativamente vicini per numerose matrici di campioni, il test CALUX e le analisi chimiche possono differire significativamente per una serie di fattori:
  1. Il CALUX analizza tutta l’attività biologica (abilità di induzione genica) di tutti i ligandi AhR (agonisti e antagonisti) presenti nel campione, mentre le analisi GC-MS si focalizzano su di un numero selezionato di composti
  2. Nella GC-MS i composti non rivelati non contribuiscono al calcolo del TEQ totale o il loro contributo è stimato (in genere rappresentato come ½ del limite di rivelabilità) mentre nelle analisi CALUX tutti i ligandi AhR (agonisti e anatagonisti) presenti nell’estratto contribuiscono al valore finale del TEQ
  3. Le interazioni non addittive (o almeno una parte) possono essere prese in considerazione nelle analisi CALUX se tutti i composti sono presenti nell’estratto pulito ma non possono essere determinati nelle analisi GC-MS
Prendendo in considerazione queste differenze, risulta che il CALUX e le analisi chimiche GC-MS possono essere molto vicini per alcuni campioni ma molto differenti per latri. Queste differenze dipendono dalla concentrazione relativa dei diversi ligandi AhR (agonisti e antagonisti), dal metodo di pulizia applicato nel CALUX, dal numero di composti diossino-simili analizzati e dai limiti di rivelabilità della GC-MS. Confrontato con metodi strumentali di determinazione del TEQ, il fatto che il biosaggio CALUX non permetta di determinare direttamente l’equivalente tossico di una miscela complessa, ma soltanto la potenza di induzione genica di un TCCD equivalente, significa che esso non costituisce un appropriato sostituto per la GC-MS.
Tuttavia, sebbene il CALUX e le analisi strumentali siano strumenti differenti, essi risultano essere complementari e possono fornire risultati comparabili in merito a quantificazioni relative di composti diossino-simili. Nonostante le sue limitazioni, l’analisi CALUX è al giorno d’oggi uno dei migliori strumenti per la valutazione degli equivalenti TCCD di un campione sconosciuto. Inoltre questo metodo combinato con un’appropriata procedura di pulizia fornisce una misura economica e rapida dell’attività diossino simile in un estratto, anche se il responso non riflette necessariamente l’effettiva “tossicità globale dei diossino-simili”.